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Caspase-3實(shí)驗(yàn)代測

Caspase家族活性的檢測

      Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用。在正常狀態(tài)下， Caspase家族都以無活性的酶原(30～50kD)形式表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時Caspase可以被蛋白酶裂解，大亞基和小亞基形成活化的Caspase 。一些Caspase活化后可以次序激活其他Caspase形成Caspase級聯(lián)反應(yīng)，促發(fā)細(xì)胞凋亡。在目前已知的14種Caspase中，Caspase-3、8和9與凋亡的關(guān)系為密切，在細(xì)胞凋亡中起執(zhí)行凋亡的作用。將Caspase序列特異性的多肽偶聯(lián)至發(fā)色基團(tuán)，當(dāng)該底物被特定的caspase剪切后，發(fā)色基團(tuán)即游離出來，可通過酶標(biāo)儀或分光光度計（λ=405nm 或400nm）測定其吸光值，考察caspase的活化程度。
Caspase家族屬于半胱氨酸蛋白酶，相當(dāng)于線蟲中的ced一3，具有高度同源性。這些蛋白酶均有以下特點(diǎn)：①總是在天冬氨酸之后切斷底物，所以命名為caspase(cysteine aspartate—specific protease)。②酶活性依賴于半胱氨酸殘基的親核性。③通常以酶原的形式存在，為由兩大、兩小亞基兩兩組成的異四聚體。大、小亞基由同一基因編碼，在受到激活后前體被切割，產(chǎn)生兩個活性亞基。這些蛋白酶是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，一旦信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，caspase被活化，隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)的酶被激活，可降解細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì)，終導(dǎo)致細(xì)胞不可逆地走向凋亡。
它們的活性位點(diǎn)均包含半胱氨酸殘基，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵，故名。caspase負(fù)責(zé)選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡。
早發(fā)現(xiàn)人類中與線蟲ced一3同源的基因是ICE(interleukin一1 p—convertingenzyme白介素1 p轉(zhuǎn)換酶)基因，因該酶能將白介素一1前體切割為活性分子而得名。通過cDNA雜交和基因組數(shù)據(jù)庫查找分析，在人類細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)11個ICE同源物，分為2個亞(subgroup)：ICE家族和CED一3家族。前者參與炎癥反應(yīng)，后者參與細(xì)胞凋亡。后者又分為兩類：一類為執(zhí)行者(executioner，effector)，如caspase一3、caspase一6、caspase一7，它們可直接降解細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通過自催化(autocatalytic)或自剪接的方式激活；另一類為啟動者(initiator)，如caspase一8、caspase一9，受到信號刺激能通過自剪接而激活，然后引起caspase級聯(lián)反應(yīng)，如caspase一8可依次激活caspase～3、caspase一6、caspase一7。啟動蛋白(initiataor)和效應(yīng)蛋白(effector)分別在死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游和下游發(fā)揮作用。

Caspase-3實(shí)驗(yàn)代測