牛口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒真的很好用
更新時間：2020-08-05 點擊次數(shù)：2362次牛口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒真的很好用
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【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒
英文名稱：Liquid-phase Blocking ELISA Kit for Detecting FMDV Type O Antibodies
【規(guī)格】96T×2塊
【用途】
檢測牛血清中的口蹄疫O型抗體，適用于動物疫苗免疫抗體監(jiān)測。
【儲藏與有效期】2～8℃保存，有效期12個月。
【主要組份】
| 序號 | 組份名稱 | 數(shù)量 |
| 1 | FMDV-O抗原包被板 | 96T×2塊 |
| 2 | HRP-O型FMD單抗 | 12mL×1瓶 |
| 3 | 樣品稀釋液 | 20mL×1瓶 |
| 4 | FMDV-O陰性對照 | 1.0mL×1管 |
| 5 | FMDV-O陽性對照 | 1.0mL×1管 |
| 6 | 單組份TMB | 12mL×1瓶 |
| 7 | 終止液 | 12mL×1瓶 |
| 8 | 濃縮洗滌液(20×) | 20mL×1瓶 |
| 9 | 說明書 | 1份 |
【試驗操作】
1、洗滌液配制
將濃縮洗滌液(20×)用蒸餾水或去離子水稀釋成洗滌液(1×)，即1份濃縮洗滌液加入19份蒸餾水，配制的洗滌液(1×)作為洗板用。
2、定性檢測方案(單孔定性，每板檢測92份血清樣本)
【操作步驟】
2.1加樣:設陰性對照血清(A1B1)和陽性血清(C1D1)各2孔，直接加入50ul/孔對照血清；其它為被檢樣品孔，預先在相應孔內(nèi)加入45ul的稀釋液，接著加入5ul/孔待檢血清；后，在所有孔內(nèi)均加入50ul的HRP-O型FMD單抗，被檢血清即為1：20稀釋。振蕩，混勻，37℃溫育30分鐘。
2.2TMB底物：用洗滌液洗板3遍，后一次拍干，加入TMB底物，50ul/孔，37℃溫育15分鐘。
2.3反應終止： 加入終止液，50ul/孔，終止反應。
2.4讀值：酶標儀450nm波長讀數(shù)。
【計算方法】
2.5阻斷率計算
陰性對照平均值=（OD-A1+OD-B1）/2;
陽性對照平均值=（OD+C1+OD+D1）/2;
樣品阻斷率 PI=[（陰性對照平均值-樣品OD值）/陰性對照平均值]
據(jù)以上公式計算被檢樣品和陽性對照樣品的阻斷率。
2.6試驗成立
兩孔陰性對照OD450nm值至少一孔OD值大于0.5；兩孔陽性對照至少一孔的阻斷率大于60%。
【結(jié)果判定】
被檢樣品PI≥50%判為口蹄疫病毒O型抗體陽性；PI＜50%判為口蹄疫病毒O型抗體陰性。
3、定量檢測方案(每板檢測10或20份血清樣本)
在使用前，所有的試劑盒組份應恢復到室溫。試劑應輕輕旋轉(zhuǎn)或振蕩混勻。每個樣品使用一個單獨的吸頭。
3.1樣品稀釋: 取出FMD－O抗原包被板，根據(jù)不同的需要，選擇圖1或圖2中的一種布局進行操作。圖1為可檢測10份樣品布局圖；圖2為可檢測20份樣品布局圖。每次試驗，每板均需設置陰陽性血清對照及4孔不加血清單抗對照。
以圖1為例操作，A1～A10每孔各加75µL的稀釋液，其它所有孔內(nèi)各加入50µL的稀釋液。A1～A10每孔各加25µL的待檢樣品，A11孔加50µL的陽性對照，A12孔加50µL的陰性對照，用排槍吹打混勻（每孔吹打3～5次），待檢樣品A1～A10分別以50µL/孔的量從A到H連續(xù)2倍稀釋；陽性對照A11以50µL/孔的量從A到H連續(xù)2倍稀釋；陰性對照A12以50µL/孔的量從A到B連續(xù)2倍稀釋。待檢樣品在第1～10列從1:4稀釋至1:512；陽性對照，從1:2稀釋至1:256，由于試劑盒提供的陽性對照已1:4稀釋，則變?yōu)閺?:8稀釋至1:1024；陰性對照，從1:2稀釋至1:4。
3.2 加入HRP－O型FMD單抗：樣品稀釋好后，在所有孔內(nèi)加入50ul的HRP－O型FMD單抗，反應體系即為100µL/孔。加樣完畢后，所有稀釋度翻倍，待檢樣品從1:8～1:1024，陽性對照從1:16～1:2048，陰性對照從1:4～1:8，貼封板膜，振蕩混勻。將加好樣的ELISA反應板置于37℃溫育30分鐘。
3.3洗板：用230μL（±20μL）洗滌液(1×)洗滌板孔，共洗滌3次。每次洗滌后應棄去孔內(nèi)的液體。在后一次洗滌液棄去后，將孔中殘留的洗滌液拍干。按50μL/孔加入TMB底物，37℃避光溫育10～15min。
3.4讀值： 每孔再加50μL終止液終止反應，立即在450nm波長下讀取OD值。
| 圖1 96孔板檢測10份樣品布局圖 | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | S1 1:8 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | 1:16 | 1:4 |
| B | 1:16 | 1:32 | 1:8 | |||||||||
| C | 1:32 | 1:64 | 空白 | |||||||||
| D | 1:64 | 1:128 | 空白 | |||||||||
| E | 1:128 | 1:256 | 不加血清單抗 對照 | |||||||||
| F | 1:256 | 1:512 | ||||||||||
| G | 1:512 | 1:1024 | ||||||||||
| H | 1:1024 | 1:2048 | ||||||||||
| 圖2 96孔板檢測20份樣品布局圖 | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | S1 1:16 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | 1:16 | 1:4 |
| B | 1:32 | 1:32 | 1:8 | |||||||||
| C | 1:64 | 1:64 | 空白 | |||||||||
| D | 1:128 | 1:128 | 空白 | |||||||||
| E | S11 1:16 | S12 | S13 | S14 | S15 | S16 | S17 | S18 | S19 | S20 | 1:256 | 不加血清單抗 對照 |
| F | 1:32 | 1:512 | ||||||||||
| G | 1:64 | 1:1024 | ||||||||||
| H | 1:128 | 1:2048 | ||||||||||
【結(jié)果分析】
3.5試驗成立判斷
不加血清單抗對照OD值應在2.0±1.5范圍內(nèi)；
陽性對照抗體效價不低于1:1024±1滴度；
陰性對照抗體效價應＜1:8。
3.6結(jié)果判定
不加血清單抗對照4孔，棄去和低OD值，計算剩余2孔的平均OD值，再除以2，即得50%對照值，該值即為臨界值，表示阻斷50％反應的對照OD值。待檢樣品OD值＞臨界值，判為陰性孔；待檢樣品OD值≤臨界值，判為陽性孔。每份待檢樣品系列梯度稀釋中，陽性孔的高稀釋倍數(shù)即為該待檢樣品的抗體效價。若臨界值處于兩個稀釋孔OD值之間，抗體效價取相鄰陽性孔和陰性孔稀釋倍數(shù)的反對數(shù)中間值。如臨界值處于1:64（反對數(shù)值為1.8）與1:128（反對數(shù)值為2.1）之間，則判定該份待檢樣品的抗體效價為1:90（反對數(shù)值為1.95）。
抗體效價≥64，為疫苗免疫合格。
抗體效價計算對照表（反對數(shù)值）
| 抗體效價 | Log10(效價) 對照計算 | 抗體效價 | Log10(效價) 對照計算 | 抗體效價 | Log10(效價) 對照計算 |
| 1:4 | 0.6 | 1:32 | 1.5 | 1:256 | 2.4 |
| 1:6 | 0.75 | 1:45 | 1.65 | 1:360 | 2.55 |
| 1:8 | 0.9 | 1:64 | 1.8 | 1:512 | 2.7 |
| 1:11 | 1.05 | 1:90 | 1.95 | 1:720 | 2.85 |
| 1:16 | 1.2 | 1:128 | 2.1 | 1:1024 | 3 |
| 1:22 | 1.35 | 1:180 | 2.25 | 1:1440 | 3.15 |
4、注意事項
4.1 為使您的實驗獲得正確結(jié)果，請您在實驗前仔細閱讀本說明書。
4.2 所有試劑使用前恢復至室溫(18～26℃)，以免溫度過低影響抗原抗體反應。
4.3實驗前應用溫度計檢查溫箱溫度，溫度過高或過低影響OD值高低。
4.4 包被板反應時嚴禁堆疊放置，應該平鋪且板間有空隙，不要離溫箱壁太近。
4.5實驗所用移液器及設備應定期校準。
4.6采集的樣品要新鮮，并且不要溶血。血清標本在2～8℃放置不要超過2天，室溫不超過8小時，如需長時間放置應儲存于-20℃。
牛口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒真的很好用
