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T細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒操作步驟說(shuō)明-信帆生物

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T 細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
一：試劑盒組成：

1. 防脫片劑2ml
2. 固定液10ml
3. A 小鼠抗人CD3 單抗1ml
B 小鼠抗人CD4 單抗1ml
C 小鼠抗人CD8 單抗1ml
4. 生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG（ IgG/Bio） 1.5ml × 2
5. 堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素(S-A/AP) 1.5ml × 2
6. A 底物增強(qiáng)劑（ 40×) 200μl
B 底物液（ 40× ) 200μl
C 底物緩沖液（ 10× ) 800μl
7. 細(xì)胞核復(fù)染液5ml
8. 封片劑1ml
9. 記號(hào)筆1 支
10. PBS 2 包(1000ml)
二：標(biāo)本制備：
取肝素抗凝（25μl/ml）的靜脈血1~2ml，PBS 稀釋1-2 倍后，沿裝有等量淋巴細(xì)
胞分離液的試管壁混勻緩慢加至液面上層，保持兩種液體界面清晰，離心（2000
轉(zhuǎn)/分）15-20 分鐘，吸取兩液面交界處的單個(gè)核細(xì)胞層，加5 倍PBS，離心（1000
轉(zhuǎn)/分）5 分鐘，棄上清液，沉淀即為單個(gè)核細(xì)胞。利用試管中剩余的少許回流
液體（約一滴）混勻細(xì)胞，制成單個(gè)核細(xì)胞懸液。滴30μl 細(xì)胞懸液于載玻片上，
靜置2 分鐘使細(xì)胞下沉粘附于玻片上，吸去液體，快速吹干或37℃溫箱1 小時(shí)
烤干。或用PBS 將單個(gè)核細(xì)胞調(diào)至2×105 個(gè)/ml，離心涂片機(jī)1000 轉(zhuǎn)離心1-2
分鐘制片，快速吹干或37℃溫箱1 小時(shí)烤干。涂片前取防脫片劑5-10μl 均勻推
片，亦可用棉簽粘取防脫片劑均勻涂于干凈玻片上，待干后制備細(xì)胞涂片，以防
掉片。
三：顯色劑的配制：
分別取A 液25ul，B 液25ul 置于干凈試管中混勻，室溫放置2-5 分鐘，加1ml
蒸餾水，混勻，再加C 液100ul 待用。
*使用前，根據(jù)所需顯色劑用量，按照以上比例現(xiàn)配現(xiàn)用。
四：標(biāo)本染色：
1. 充分干燥（室溫2 小時(shí)以上或過(guò)夜）的細(xì)胞涂片先用記號(hào)筆在標(biāo)本外畫圈，
然后滴加固定液50μl，室溫靜置2-3 分鐘，用PBS 淋洗，擦干玻片背面及細(xì)胞
外的PBS。

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*以下反應(yīng)均需在濕盒中進(jìn)行。
2. 分別滴加抗人CD3、CD4、CD8 單抗適量（10-30μl）， 4℃過(guò)夜，PBS 淋洗3
次。
3. 滴加生物素標(biāo)記抗小鼠IgG 適量（10-30μl），37℃孵育30-45 分鐘，PBS 淋
洗3 次。
4. 滴加堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素適量（10-30μl）37℃孵育30-45 分鐘，PBS
淋洗3 次。
5. 滴加顯色劑30-50μl，室溫顯色20-40 分鐘。可在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞膜上
出現(xiàn)紅色標(biāo)記物時(shí)，用PBS 淋洗。
6. 滴加細(xì)胞核復(fù)染液30-50μl，30 秒后自來(lái)水淋洗。
7. 滴加封片劑，蓋片封片，鏡檢。如不需保存亦可用水替代封片劑蓋片鏡檢。
五：觀察：
高倍鏡下選取染色好的視野記數(shù)100-200 個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞表面有紅色標(biāo)記物
為陽(yáng)性細(xì)胞。算出陽(yáng)性率。
六：正常參考值：
正常人外周血中，陽(yáng)性細(xì)胞百分率一般在：CD3，60-80%；CD4，35-55%；CD8，
20-30%；CD4/CD8 的比值在1.5-2.0 范圍內(nèi)。

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