信帆生物：免疫組化與抗原修復技術的應用
更新時間：2016-04-22 點擊次數：1313次福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質分子間相互交聯形成大分子網絡，也導致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應。因此，抗原修復也是影響免疫組化染色結果的基本因素。抗原修復(Antigen retrieval ，AR)技術，建立在Fraenkel-conrat等人[1]一系列生物化學研究，經1991年shi等人[2]發展?？乖迯褪侵甘?、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學(IHC)前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復過程?？乖迯湍躾ui大程度地恢復在制片等過程中損失的抗原性，使原來認為不能在石蠟切片上進行IHC的許多抗體獲得了良好的染色結果，成為一種有效的補救措施。本文的目的是概述AR-HIC的發展、應用和標準化。
一、 AR技術
加熱AR技術
微波加熱方法. 在傳統標準方法,經脫蠟、脫水和用3%H2O2阻斷內源性過氧(化)物酶，石蠟切片經蒸餾水沖洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸餾水、緩沖液、金屬鹽液、尿素等，蓋上并置家用微波爐加熱5或10分鐘(注意防止切片干躁)。有時在加熱5分鐘后，間隔1分鐘，再加熱5分鐘(在*個5分鐘后檢測液體高度)。加熱后，從微波爐取出塑料Coplin缸，冷卻15分鐘。片子經蒸餾水沖洗二次后在PBS液中浸5分鐘，才進行IHC染色。為了保持一致的加熱條件，必須設定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號的Coplin缸 ，按照不同的抗體設定不同的加熱時間，盡可能的建立標準的加熱條件。
微波(MW)加熱過程如下：在盒內放入200ml檸檬酸緩沖液(PH6.0±0.1)，并蓋上帶有小孔的蓋子，微波加熱至沸騰;將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中，放入已沸騰緩沖液中，有作者提供做免疫組化時采用微波爐中等功率800W[3]，微波爐選用解凍檔的國產家用微波爐(根據目前的研究,建議用醫用微波爐)，中檔繼續處理10-20分鐘;取出微波塑料缸冷卻至室溫，從緩沖液中取出玻片，片子經蒸餾水沖洗二次，之后用PBS(PH7.2-7.4)沖洗兩次，每次3分鐘。
盡管有少數作者[4]認為經高溫后冷卻這一步省略。在我們觀點，15分鐘的冷卻必須的幾點理由：1、如這一步省略，對于有些抗體而言，會降低AR-IHC染色強度。2、突然從高溫到低溫可導致組織片掉片。3、可能引起形態學的變化。
單純加熱方法. 將切片放入盛有檸檬酸緩沖液的容器中,置電爐(600W)上加熱至沸騰，并持續10min 。Shi等人[2]用單純加熱方法與微波加熱方法比較IHC染色強度，顯示兩種方法導致相同的染色強度。
高壓加熱方法. Shin等人[5]發展了含水高壓鍋煮沸方法，來增強福爾馬林固定的腦組織tau蛋白免疫反應性。將切片連同檸檬酸緩沖液放入高壓鍋內，加熱至產生噴氣，并持續2min，壓力鍋離開熱源，加熱長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋到壓力鍋離開熱源總時間在5-8分鐘，時間過長可能會使染色背景加深?，F試劑公司提供的大多數抗體都建議使用高壓鍋煮沸方法，這幾年的實踐表明，采取此方法可避免假陽、陰性，使IHC染色效果更佳。
非加熱AR技術
非加熱AR技術包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化學的方法來打斷醛鍵，修復抗原。
胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05%或0.1%PH7.8的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可;或由邁新提供的0.125%的液體胰酶。將切片放入濕盒內37oC溫箱中消化18-20分鐘。
胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4%的胃蛋白酶;
鏈霉蛋白酶消化法 . 將鏈霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，濃度為o.1%，消化時間20min。
抗原修復的方法選擇，關系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應當根據不同的抗原特點，采用不同的修復方法。對某些細胞內抗原(如Fas、Bax、FⅧ等)和細胞間質抗原(如Laminin、CoIV等)則需要用酶消化法處理切片。常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細胞內抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細胞間抗原的消化。工作中要認真參照抗體說明書指示進行消化酶的選擇，這樣針對性更強，標記效果更理想。
總之,以高壓加熱方法、微波加熱方法較為穩定, 高壓加熱方法效果優于微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對修復效果無任何影響，而PH值則影響。緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCL較常用。前人的研究表明，溫度高修復時間短[6]。解放軍第251醫院根據病理診斷、鑒別診斷和研究的實際需要，在抗原修復方法規范研究和應用的基礎上，創用了胰蛋白酶—尿素聯合消化技術、鹽酸水解暴露抗原技術和MW—表面活性劑Triton X—100(MW—TX)修復抗原技術 [7] 。抗原暴露或抗原修復方法較多，其中發MW—枸櫞酸緩沖液使用較多，效果。MW修復抗原的方法是石蠟切片脫蠟、水洗后放入修復液中，用250W的輸出功率2X5min，待冷卻至室溫按常規處理。目前AR過程已成功應用在BioTek全自動免疫組化染色儀中。
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